Modellierung und Optimierung der parallelisierten immunmagnetischen Nanoporensortierung zur oberflächenmarkerspezifischen Isolierung extrazellulärer Vesikel aus komplexen Medien

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 13292 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Isolierung spezifischer Subpopulationen extrazellulärer Vesikel (EVs) auf der Grundlage ihrer Expression von Oberflächenmarkern stellt aufgrund ihrer Nanogröße (< 800 nm), ihrer heterogenen Oberflächenmarkerexpression und der großen Anzahl von Hintergrund-EVs in klinischen Proben eine erhebliche Herausforderung dar (1010–1012 EVs/ml im Blut). Durch die hochparallelisierte nanomagnetische Sortierung mithilfe von TENPO-Chips (Track Etched Magnetic Nanopore) wurde eine präzise immunspezifische Sortierung mit hohem Durchsatz und Widerstandsfähigkeit gegenüber Verstopfungen erreicht. Es gab jedoch noch keine systematische Untersuchung der Designparameter, die bei diesem Ansatz die Kompromisse in Bezug auf Durchsatz, Ziel-EV-Wiederherstellung und Fähigkeit, Hintergrund-EVs zu verwerfen, steuern. Wir kombinieren Finite-Elemente-Simulation und experimentelle Charakterisierung von TENPO-Chips, um Designregeln zur Isolierung von EV-Subpopulationen aus Blut aufzuklären. Wir demonstrieren den Nutzen dieses Ansatzes, indem wir den Gerätehintergrund im Vergleich zu früheren veröffentlichten Designs um mehr als das Zehnfache reduzieren, ohne die Rückgewinnung der Ziel-EVs zu beeinträchtigen, indem wir den Porendurchmesser, die Anzahl der in Reihe geschalteten Membranen und die Durchflussrate auswählen. Wir vergleichen TENPO-isolierte Elektrofahrzeuge mit denen von Goldstandardmethoden zur Elektrofahrzeugisolierung und demonstrieren deren Nutzen für eine breite Anwendung und Modularität, indem wir auf Subpopulationen von Elektrofahrzeugen aus mehreren Krankheitsmodellen abzielen, darunter Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Leberkrebs.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nanoskalige (< 800 nm) Membranpartikel, die Nukleinsäureladungen enthalten und Oberflächenproteine exprimieren, die ihre Ursprungszellen widerspiegeln1. Aufgrund ihrer vielfältigen Ladungen und ihrer Fähigkeit, anatomische Barrieren wie die Blut-Hirn-Schranke zu umgehen und in peripheren Körperflüssigkeiten wie Blut (1010–1012 EVs/ml)2 und Urin (1010 EVs/ml)3 zu zirkulieren, haben sich Elektrofahrzeuge zu einer großen Bedeutung entwickelt eine vielversprechende Biomarkerquelle für die Diagnose und Charakterisierung mehrerer Krebsarten4,5,6,7,8,9 sowie in anderen Krankheitskontexten, einschließlich traumatischer Hirnverletzung10 und Infektionskrankheiten11. Darüber hinaus spielen Elektrofahrzeuge eine mechanistische Rolle bei biologischen Prozessen wie der Metastasierung12 und Tumor-Immun-Interaktionen bei Krebs13 sowie bei Pathologien wie traumatischen Hirnverletzungen14, Autoimmunerkrankungen15 und Herzstillstand16.

Derzeit wird die Erforschung von Elektrofahrzeugen und ihrem Potenzial für Diagnostik und Therapie durch Technologien behindert, die nicht darauf ausgelegt sind, ihre einzigartige Kombination aus nanoskaliger Größe, Komplexität und Menge in Bioproben zu berücksichtigen. Die hohe Konzentration von Elektrofahrzeugen im Blut stellt eine besondere Herausforderung für Forscher dar, die eine bestimmte Elektrofahrzeug-Subpopulation von anderen Elektrofahrzeug-Subpopulationen sowie anderen Nicht-Elektrofahrzeug-Partikeln wie Zelltrümmern im gleichen Größenbereich (nicht relevanter „Hintergrund“) unterscheiden möchten. . Aktuelle Goldstandard-EV-Isolierungsmethoden wie Ultrazentrifugation, kommerzielle Fällungskits (Thermo Fisher, System Biosciences) und Größenausschlusschromatographie verfügen nicht über die Oberflächenmarkerselektivität und den Durchsatz, um EV-Subpopulationen präzise zu sortieren17.

Ebenso sind bisher etablierte Methoden zur Sortierung von Zellen nach Oberflächenmarkern nicht in der Lage, nanoskalige Elektrofahrzeuge zu messen oder den Durchsatz zu erreichen, um die große Anzahl von Elektrofahrzeugen zu verarbeiten, die typischerweise in klinischen Proben zu finden sind. Beispielsweise wäre die Verarbeitung von ~ 1011 EVs in 1 ml Blut für die Zelldurchflusszytometrie mit hohem Durchsatz nicht möglich. Typische Nanopartikel-Durchflusszytometer sortieren mit einer Geschwindigkeit von ca. 1.000 Zählvorgängen/Sekunde18 und benötigen ca. 3 Jahre, um 1 ml Blut zu sortieren, während selbst die neuesten subzellulären Durchflusszytometriesysteme, die ca. 60.000 Ereignisse/Sekunde sortieren,19 19 Tage für 1 ml benötigen würden Blut. Diese Herausforderung wird durch die geringe absolute Expression von Oberflächenproteinen auf EVs im Vergleich zu Zellen aufgrund der dramatisch vergrößerten Oberfläche einer ~ 10 µm-Zelle im Vergleich zu einem < 800 nm EV verstärkt, was zu Fluoreszenzsignalen führt, die unterhalb der Nachweisgrenze liegen kommerzielle Durchflusszytometriesysteme20. Als Reaktion auf diese Herausforderung wurden mehrere mikrofluidische Ansätze entwickelt, die mikro-/nanoskalige Strukturgrößen in EV-Größe verwenden, um eine präzise größenbasierte oder Oberflächenmarker-EV-Sortierung durchzuführen. Allerdings haben Einschränkungen wie die Anforderung einer komplexen Nanofabrikation4,21,22, geringe maximale Eingabevolumina23,24, die Abhängigkeit von einem einzelnen molekularen Biomarker-Target25 oder ein geringer Probendurchsatz21 die Anwendbarkeit der mikrofluidischen Größen- oder Oberflächenmarker-EV-Sortierung behindert.

Um die Mängel früherer Generationen von Mikrofluidikgeräten bei der Isolierung von Elektrofahrzeug-Subpopulationen zu beheben, hat unsere Gruppe Track-Etch-Magnet-NanoPOre-Chips (TENPO) entwickelt, um die parallelisierte immunmagnetische Sortierung von Elektrofahrzeugen basierend auf ihren Oberflächenproteinen durchzuführen5. Durch die Ausweitung der Parallelisierung der immunmagnetischen Sortierung auf Millionen von spurgeätzten magnetischen Nanoporen ist TENPO resistent gegen Ausfälle aufgrund von Verstopfungen in einzelnen Poren, da eine Verstopfung dazu führt, dass sich die Flüssigkeit gleichmäßig auf die Millionen anderer magnetischer Nanoporen verteilt. Darüber hinaus erhöht der Parallelbetrieb von Millionen von Nanoporen den Durchsatz und die Probenflussraten, da die individuelle Strömungsgeschwindigkeit pro Pore aufgrund der hohen Porendichte (> 107 Poren/cm2 für d = 600 nm Poren5, > 106 für d) niedrig gehalten werden kann = 3 µm Poren pro Cytiva/Whatman). Schließlich ermöglicht das Spurätzen in Kombination mit der Dampfabscheidung einer Doppelschicht, die aus einer weichmagnetischen Schicht aus NiFe und einer Passivierungsschicht aus Au besteht, die kostengünstige Herstellung einer großen Anzahl präzise definierter magnetischer Nanoporen unter Umgehung teurer und schwer skalierbarer Lithographie5.

Um spezifische EV-Subpopulationen zu isolieren, werden EVs zunächst mit biotinylierten Antikörpern markiert, die für interessierende Oberflächenmarker spezifisch sind, und dann an 50 nm große magnetische Anti-Biotin-Nanopartikel (MNPs) konjugiert. EVs, die einen bestimmten Oberflächenmarker stark exprimieren, werden daher im Vergleich zu EVs, die den Oberflächenmarker schwach oder nicht exprimieren, stark mit MNPs markiert (Abb. 1A, links). EV-MNP-Komplexe werden mit einer Spritzenpumpe vertikal durch die magnetischen Nanoporen gezogen, und nur EVs, die mit einer ausreichenden Anzahl an MNPs markiert wurden, verfügen über eine ausreichend starke magnetophoretische Kraft, um die Widerstandskraft der durch die Pore fließenden Flüssigkeit zu überwinden (Abb . 1A, Mitte). Im Gegensatz zu lichtbasierten Messungen, deren Längenskala durch die Wellenlänge des Lichts eingeschränkt ist, unterliegt die Magnetostatik keiner Einschränkung in der Längenskala5,26 und wird durch das Fehlen eines signifikanten Hintergrundmagnetismus in peripheren Körperflüssigkeiten wie Blut und Urin unterstützt. Im TENPO-Workflow werden eingefangene EVs für die nachgeschaltete Nukleinsäure- oder Proteinquantifizierung lysiert (Abb. 1A, rechts) oder als Ganzes für die EV-Charakterisierung eluiert (z. B. Nanopartikel-Tracking-Analyse, NTA). Mit TENPO können mehrere EV-Subpopulationen bei einer Krankheit (z. B. Neuronen vs. von Astrozyten abgeleitete EVs bei Demenz) in einem schnellen, kostengünstigen Chip-basierten Format für die nachgelagerte Ladungsanalyse isoliert werden.

Charakterisierung der TENPO-Isolierung von EV-Subpopulationen. (A) Schematische Darstellung der spurgeätzten magnetischen Nanoporen-EV-Isolierung. Elektrofahrzeuge werden zunächst mit biotinylierten Fängerantikörpern markiert, gefolgt von magnetischen Anti-Biotin-Nanopartikeln (50 nm). EV-MNP-Komplexe werden magnetisch eingefangen, während sie vertikal durch parallelisierte magnetische Nanoporen fließen. (B) Illustrationen von Kompromissen bei der TENPO-Isolation. Die Anpassung der Designparameter – Porendurchmesser d, Durchflussrate ɸ und Anzahl der Membranen n – führt zu Kompromissen, die zur Anpassung von TENPO verwendet werden können, um bestimmte EV-Subpopulationen aus klinischen Proben zu isolieren. (C) Foto eines zusammengebauten TENPO-Chips (links) und REM-Aufnahmen der magnetischen TENPO-Nanoporen (Mitte und rechts) mit einem auf dem Chip immobilisierten EV (rechts). (D) Ein Schema des Arbeitsablaufs dieser Studie.

Ein wesentliches Merkmal des TENPO-Designs besteht darin, dass das Einfangen von Elektrofahrzeugen oder das Verstopfen von Poren keinen wesentlichen Einfluss auf die Leistung des Geräts hat, bis > 10 % der magnetischen Nanoporen verschlossen sind. Dieses Merkmal entsteht, weil der Fluidwiderstand der magnetischen Nanoporen um mehrere Größenordnungen größer ist als der Widerstand zwischen den Poren. Wenn eine Pore verschlossen ist, wird die Strömung daher nicht nur auf ihre nächsten Nachbarn, sondern gleichmäßig über die gesamten 107 Poren verteilt wenn sie in einer Parallelschaltung27 geschaltet sind. Darüber hinaus ist bei vielen Anwendungen der Isolierung spezifischer Subpopulationen von EVs die Subpopulation spärlich (z. B. ~ 1900 von Tumoren abgeleitete EVs/ml pro mm3 Tumorvolumen bei Tumoren mit hoher Ausscheidung)28 im Vergleich zur Gesamtzahl der EVs. Daher werden selbst in einem Fall, in dem TENPO 1011 Elektrofahrzeuge in einem ml menschlichem Plasma verarbeitet, mehrere Größenordnungen weniger gezielte Elektrofahrzeuge auf den ~ 107 magnetischen Nanoporen des TENPO eingefangen. Da unser Gerät Elektrofahrzeuge einzeln sortiert, kann es Elektrofahrzeuge anhand der quantitativen Expression von Oberflächenmarkern sortieren, ähnlich wie bei der Durchflusszytometrie für die zellbasierte Sortierung. Dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die Perlen oder Geräte in Mikrometergröße verwenden29, bei denen die EV-Erfassung durch ein einzelnes Bindungsereignis bestimmt wird. Darüber hinaus waren frühere Methoden zur Isolierung von Immunaffinitätsperlen durch die Anforderung eingeschränkt, dass ein hoher Anteil der EVs ein bestimmtes Zielprotein exprimieren muss30.

Über eine grundlegende Bewertung der Leistung von TENPO anhand einfacher Modellsysteme wurde bereits berichtet5,31. Die TENPO-basierte EV-Isolierung aus Blut hat sowohl die Diagnose als auch die Metastasenerkennung bei Bauchspeicheldrüsenkrebs mit einer Genauigkeit durchgeführt, die herkömmlichen Methoden überlegen ist5,6, und wurde bei der Diagnose traumatischer Hirnverletzungen angewendet10.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine systematische Untersuchung der Designparameter, die bei diesem Ansatz die Kompromisse in Bezug auf Durchsatz, Ziel-EV-Wiederherstellung und Verwerfen von Hintergrund-EVs/Nicht-EV-Trümmern steuern. Wir tun dies, indem wir Finite-Elemente-Simulation und experimentelle Charakterisierung von TENPO-Chips kombinieren, um die Entwurfsregeln für die Isolierung von EV-Subpopulationen zu verdeutlichen (Abb. 1B).

1) Porendurchmesser d Frühere Versionen von TENPO verwendeten eine Porengröße von d = 600 nm, um die Größe der Gerätemerkmale nahe an die Größenskala von EVs5 zu bringen. Porengrößen im Nanomaßstab können jedoch dazu führen, dass größere EVs wie Mikrovesikel (~ 100–1000 nm) sowie Nicht-EV-Hintergrund, wie Zelltrümmer und apoptotische Körper, größenabhängig eingefangen werden32 (Abb. 1B). Obwohl die Vorverarbeitungsschritte aggressiver gestaltet werden können, um größere Materialien zu entfernen, besteht die Gefahr, dass Ziel-EVs verloren gehen. Während eine Erhöhung von d das größenbasierte Einfangen reduziert, um die Reinheit zu verbessern, besteht die Gefahr, dass sich die Distanz erhöht, die Ziel-EV-MNP-Komplexe zum Einfangen am Porenrand zurücklegen müssen, wodurch die Ziel-EV-Ausbeute sinkt.

2) Flussrate ɸ Durch Einstellen der Probenflussrate ɸ, mit der die Probe durch TENPO fließt, kann die Ausbeute für gezielte EVs im Vergleich zur erfolgreichen Verwerfung von Hintergrund-EVs ausgeglichen werden. Mit abnehmendem ɸ sind weniger gebundene MNPs erforderlich, damit ein gezieltes EV an den Rand einer Pore übertragen und eingefangen werden kann. Während dies die Ziel-EV-Ausbeute erhöht, erhöht es auch die Erfassung von Hintergrund-EVs, die aufgrund unspezifischer Adhäsion mit wenigen MNPs gebunden sind. Mit zunehmendem ɸ werden weniger schwach markierte Hintergrund-EVs mitisoliert, auf Kosten des Verlusts gezielterer EVs.

3) Anzahl der Membranen n TENPO-Membranen können in Reihe gestapelt werden, um die Einfangwahrscheinlichkeit gezielter Elektrofahrzeuge zu erhöhen, da jede Membran eine unabhängige Einfangchance bietet5 und somit die Ausbeute an Ziel-Elektrofahrzeugen erhöht. Eine Erhöhung von n führt jedoch zu einem erhöhten Totvolumen auf dem Chip (~ 25 µL pro Membran für ein 2,5-cm2-Gerät) und einer erhöhten unspezifischen Erfassung schwach markierter Hintergrund-EVs, wodurch die Reinheit verringert wird.

In dieser Arbeit charakterisieren wir den Effekt, den unterschiedliche Geräteparameter (d, ɸ, n) auf die Leistung der oberflächenmarkerselektiven EV-Sortierung mit TENPO haben (Abb. 1C). Zu diesem Zweck demonstrieren wir: (1) Finite-Elemente-Simulationen, um die Skalierung der Geräteleistung mit Geräteparametern aufzudecken, (2) experimentelle Validierung dieser Geräteskalierungsgesetze in einem Modellsystem für Bauchspeicheldrüsenkrebs, (3) Benchmarking unseres EV Isolierung nach Goldstandardmethoden und (4) die modulare Isolierung von EV-Subpopulationen über drei verschiedene Krebsmodellsysteme (Abb. 1D).

Um die Skalierungsgesetze zu identifizieren, die der Leistung von TENPO für die immunmagnetische Sortierung zugrunde liegen, führten wir zunächst eine Multiphysik-Finite-Elemente-Simulation (COMSOL) durch, die ein magnetostatisches Modell des Magnetfeldgradienten, ein Modell des mikrofluidischen Flusses durch magnetische Nanoporen und Partikelverfolgung umfasste Simulationen immunomagnetisch markierter Elektrofahrzeuge. Aufbauend auf früheren zweidimensionalen Simulationen, die sich die radiale Symmetrie jeder magnetischen Nanopore5 zunutze machten, führten wir eine dreidimensionale Simulation durch. Der Flüssigkeitsfluss wurde als strömungsgeschwindigkeitsgesteuerter (Fluss, der mit einer definierten Strömungsgeschwindigkeit durch eine Eingangsebene auf der Pore in den Kanal eintritt) laminare Zuströmung mit einer rutschfesten Randbedingung und einer periodischen Strömungsbedingung an den Simulationskanten modelliert, um eine große Strömung zu simulieren Porengitter um eine bestimmte einzelne Pore. Magnetophoretische Fallen bildeten sich am Rand der Pore in simulierten Geräten mit einem Porendurchmesser von d = 600 nm bis d = 12 µm (SI Abb. 1) in einem starken externen Magnetfeld ($|\overrightarrow{B}|$= 0,4 T) herstellbar mit einem NdFeB-Magneten (Durchmesser = 1,5 Zoll, Höhe = 0,75 Zoll, K&J Magnetics). Wir haben die magnetophoretischen Kräfte für jeden Porendurchmesser mit der Widerstandskraft am Porenrand bei einem typischen Volumenstrom von ɸ = 2,5 ml/h und einer Gerätequerschnittsfläche von a = 2,5 cm2 für beide stark markierten Elektrofahrzeuge verglichen 15 MNPs gebunden und schwach markierte EVs mit 1 MNP gebunden. In dieser Simulation haben wir herausgefunden, dass die vertikale magnetophoretische Kraft 100 nm vom Porenrand entfernt um etwa 3 Größenordnungen größer ist als die Widerstandskraft für Elektrofahrzeuge, die mit 15 MNPs markiert sind, und um etwa 2 Größenordnungen für Elektrofahrzeuge, die mit 1 MNP markiert sind (SI-Abb . 2). Daher wird für alle berücksichtigten Porendurchmesser das Einfangen von Elektrofahrzeugen dadurch bestimmt, ob ein Elektrofahrzeug magnetophoretisch zum Rand der Pore verschoben wird, bevor es mit einer Geschwindigkeit durch die Pore tritt, die durch die Volumenströmungsrate, den Porendurchmesser und die Gesamtzahl der Elektrofahrzeuge bestimmt wird Poren.

Mithilfe der oben beschriebenen Magnetfeld- und Flüssigkeitsströmungssimulationen haben wir die Flugbahnen von mit MNPs konjugierten EVs über mehrere Porendurchmesser d, Flussraten ɸ und die Anzahl der in Reihe angeordneten TENPO-Membranen n simuliert. In jeder Simulation haben wir die Flugbahn von 100 EVs betrachtet, die durch eine einzelne magnetische Nanopore aus einem gleichmäßigen quadratischen Gitter von Anfangspositionen mit einer Länge, die doppelt so groß ist wie der Porendurchmesser, und einer Höhe von 3 µm über der Pore fließen. EVs mit einem Durchmesser von 150 nm wurden entweder als „stark markiert“ mit 15 an ein EV gebundenen MNPs oder als „schwach markiert“ mit 1 an ein EV gebundenen MNP simuliert (Abb. 2A). MNPs mit einem Durchmesser von 50 nm wurden aufgrund ihrer häufigen Verwendung und Charakterisierung in der Literatur auf der Grundlage vernetzter Eisenoxid-Ferrit-Nanopartikel (CLIO) modelliert .

Finite-Elemente-Simulationen zur Charakterisierung der TENPO EV-Sortierung. (A) Partikelverfolgungssimulationen für stark markierte gegenüber schwach markierten Elektrofahrzeugen durch eine einzelne magnetische Nanopore bei einem Beispielporendurchmesser d = 1 µm und einer Beispielvolumenstromrate ɸ = 2,5 ml/h. (B) Die Einfangrate von stark markierten EVs (Rs) und schwach markierten EVs (Rw) im Vergleich zum Porendurchmesser d für einen Volumenstrom ɸ = 2,5 ml/h. (C) Die Einfangrate von stark markierten EVs und schwach markierten EVs im Vergleich zur volumetrischen Flussrate ɸ für einen Porendurchmesser d = 1 µm.

Wir modellierten zunächst die Auswirkungen des Porendurchmessers d auf die Leistung von TENPO, indem wir Porendurchmesser im Bereich von d = 600 nm bis 12 Mikrometer modellierten, eine Durchflussrate ɸ = 2,5 ml/h annahmen und die Partikelverfolgung nutzten, um ihre Fähigkeit zur starken Isolierung zu quantifizieren -getaggte versus schwach getaggte Elektrofahrzeuge. Wir haben die Erfassungsrate von stark markierten Elektrofahrzeugen als Rs und die Erfassungsrate von schwach markierten Elektrofahrzeugen als Rw definiert; Daher wurde 1-Rw verwendet, um die Fähigkeit des Geräts zu bewerten, schwach markierte Elektrofahrzeuge erfolgreich zu verwerfen. Für dieses Modellsystem ergab ein Porendurchmesser von d = 1 µm den größten Abstand zwischen Rs und Rw (Abb. 2B). Während Rs mit zunehmendem Porendurchmesser abnahm, stieg 1-Rw für d = 600 nm und 1 µm an, bevor es bei d = 3 und 12 µm ein Plateau bei 1-Rw = 100 % (Rw = 0 %) erreichte. Im Gegensatz dazu war Rs bei d = 600 nm und 1 µm maximal bei 100 %, bevor es bei d = 3 und 12 µm abnahm. In dieser Simulation ergab ein Porendurchmesser von 1 µm einen hohen Rs = 100 % und einen mäßig hohen 1-Rw = 88 %. Allerdings können klinische Proben abhängig von der Oberflächenproteinexpression eine komplexere Verteilung der MNP-Konjugation an EVs aufweisen.

Mithilfe unseres Modells haben wir als Nächstes die Auswirkung einer Variation der Anzahl der TENPO-Membranen n in Reihe auf die Leistung bewertet. Um mehrere TENPOs in Serie zu modellieren, haben wir eine iterative Simulation durchgeführt, bei der EVs, die nicht in einer Simulation erfasst wurden, dann simuliert werden, indem sie einen nachfolgenden TENPO mit einer zufälligen Anfangsposition durchlaufen, da die Platzierung der Poren in jeder Membran unabhängig voneinander ist. Wir haben eine magnetische Nanoporenkonfiguration (d = 3 µm bei einer Flussrate ɸ = 2,5 ml/h) in Betracht gezogen, die ein hohes 1-Rw (Fähigkeit, schwach markierte Vesikel zu verwerfen), aber ein niedriges Rs (Ausbeute für stark markierte Vesikel) aufweist ob Rs mit mehreren Membranen wiederhergestellt und 1-Rw konserviert werden könnte. Hier nahmen sowohl Rs als auch Rw mit zunehmendem n zu. Rs stieg bis zu n = 2–3 Membranen schneller an als Rw, was den größten Abstand zwischen Rs und Rw ergab (SI Abb. 3). Das Hinzufügen von mehr als drei Membranen erhöhte den Rw bei abnehmender Verbesserung des Rs.

Anschließend haben wir die Auswirkung der Flussrate ɸ auf die Leistung magnetischer Nanoporen mit einem Durchmesser d = 1 µm modelliert, die aufgrund ihres hohen Rs und mäßig hohen 1-Rw ausgewählt wurden. Bei Flussraten ɸ < 2,5 ml/h wurden alle stark markierten EVs erfasst. Als die Flussrate über ɸ > 2,5 ml/h hinaus anstieg, nahm Rs als Funktion der Flussrate ɸ ab. Bei Flussraten ɸ < 2,5 ml/h stieg 1-Rw als Funktion von ɸ an, und über ɸ > 2,5 ml/h hinaus wurden alle schwach gezielten EVs erfolgreich verworfen. (Abb. 2C). Dieses Modellsystem zeigt das Potenzial für die Optimierung des Kompromisses zwischen Rs und 1-Rw in diesem Modellszenario, das sowohl gezielte Elektrofahrzeuge als auch Off-Target-Elektrofahrzeuge mit nicht spezifisch gebundenen MNPs umfasst.

Wir haben auch die Auswirkungen von Verstopfungen auf die Leistung von TENPO berücksichtigt. Bei TENPO verteilt sich der Fluss gleichmäßig über eine große Anzahl magnetischer Nanoporen (N = 5,3 × 106 d = 3 µm Poren in einer 2,5 cm2 großen Membran). Die durchschnittliche Flussgeschwindigkeit durch eine einzelne Pore beträgt Vz = ɸ/(N*Apore). Dabei ist Apore die Querschnittsfläche einer Pore. Die Strömung ist tendenziell gleichmäßig über die Poren verteilt, da der berechnete Strömungswiderstand zwischen den Poren etwa zwei Größenordnungen niedriger ist als der Strömungswiderstand durch eine einzelne Pore mit d = 3 µm (SI Abb. 4). Da sich die Nanoporen so verhalten, als wären sie parallel, führt das Blockieren einer einzelnen verstopften Pore dazu, dass ihr Anteil am Fluss auf die anderen Millionen parallel arbeitender Poren auf dem Chip verteilt wird, wodurch die Auswirkungen auf die Gesamtleistung minimiert werden. In einer Finite-Elemente-Simulation von neun Poren, die parallel innerhalb einer periodischen Strömungsbedingung arbeiten, um ein großes, sich wiederholendes Gitter umgebender Poren zu simulieren, zeigen wir, dass die maximale Widerstandskraft für ein EV, das in eine nicht verschlossene Pore eintritt, um ~ 11 % erhöht wird 1 von 9 Poren im Gitter ist vollständig verschlossen, und die Zahl ist weniger als doppelt so hoch (Anstieg um ~ 80 %), selbst wenn 4 von 9 Poren vollständig verschlossen sind (SI Abb. 5). Bei der periodischen Strömungsbedingung deutet dies darauf hin, dass sich die Leistung von TENPO nicht wesentlich ändert, selbst wenn ~ 10 % der Poren vollständig auf dem Chip verschlossen sind.

Um die Auswirkung von Verstopfungen auf die Leistung einer einzelnen Pore zu bewerten, haben wir die Auswirkung von stark markierten gegenüber schwach markierten EVs auf die Strömungsgeschwindigkeit und die EV-Trajektorien für sphärische Verstopfungen mit einem Radius von 400 nm und 800 nm auf einer Pore von d = 3 µm simuliert. Wir beobachteten nur begrenzte Änderungen in den Geschwindigkeitsprofilen und Maximalgeschwindigkeiten für Verstopfungen bis zu 800 nm (SI Abb. 6). Wir haben auch Partikelverfolgungssimulationen durchgeführt, bei denen verstopfte Poren mit n = 100 stark markierten gegenüber schwach markierten EV-MNPs herausgefordert wurden. Rs und Rw änderten sich bei einer Verstopfung bei 400 nm nicht, während eine Verstopfung bei 800 nm zu einem Anstieg von Rw, aber zu unverändertem Rs führte. Bemerkenswert ist, dass sich stark markierte Elektrofahrzeuge in den 400-nm- und 800-nm-Verstopfungen um die Stelle der Verstopfung herum ansammelten, während sich bei der 800-nm-Verstopfung auch schwach markierte Elektrofahrzeuge um die Stelle der Verstopfung herum ansammelten, was auf eine erhöhte Hintergrundeinklemmung hindeutet (SI Abb. 7). ).

Die Leistung von TENPO bei der immunmagnetischen Erfassung von EV-Subpopulationen wurde experimentell in einem In-vitro-Modellsystem für Bauchspeicheldrüsenkrebs charakterisiert. Wir haben TENPO verwendet, um EVs aus Zellkulturmedien für Bauchspeicheldrüsenkrebs (250 µL, ~ 3,12 × 109 EVs pro NTA) zu isolieren, die in einen komplexen Hintergrund aus 1 ml fötalem Rinderserum (FBS, 1,03 × 1010 Partikel in EV-Größe pro NTA) gegeben wurden stellen zusätzlichen Protein- und RNA-Hintergrund bereit, um die Sortierkapazität von TENPO herauszufordern. Wir untersuchten die Auswirkung unterschiedlicher Porendurchmesser d, Membrananzahl n, Durchflussrate ɸ und Membranquerschnittsfläche a auf die Leistung. Wir verglichen auch die On-Chip-Waschflussraten (5 vs. 15 ml/h) (SI Abb. 8) und die magnetischen Feldstärken (0,45 vs. 0,34 T) (SI Abb. 9), stellten jedoch fest, dass keiner der Parameter unsere Ergebnisse veränderte . Für jede Bedingung wurden die Geräte entweder mit EVs, die an Pan-EV-Antikörper-markierte MNPs (CD9, CD63, CD81, Biolegend) konjugiert waren, um stark markierte EVs darzustellen, oder mit Isotyp-Antikörper-markierten MNPs (IgGK1, Biolegend) zur unspezifischen Darstellung herausgefordert markierte Hintergrund-/schwach markierte Elektrofahrzeuge. PCR für fünf Nukleinsäuren (KRT18, GAPDH, H3F3A, KRAS, CD635) wurde verwendet, um die Mengen an eingefangenem Nukleinsäurematerial zu messen, wobei die Cq-Werte zwischen den beiden Bedingungen verglichen wurden. Um zu bestimmen, inwieweit die Nukleinsäurespiegel mit der EV-Konzentration korrelieren, führten wir eine Reihe von Spike-in-Titrationsexperimenten durch, bei denen unterschiedliche Konzentrationen von Medien mit EVs aus Bauchspeicheldrüsenkrebszellkulturen in ein konstantes Volumen gesunden menschlichen Plasmas gegeben wurden. Aus diesen Spike-in-Proben wurden EVs mittels Ultrazentrifugation isoliert und anschließend lysiert, um die Expression von Nukleinsäuremarkern mittels PCR zu quantifizieren. Wir haben eine gute Korrelation zwischen der Konzentration von gespikten Elektrofahrzeugen in Bauchspeicheldrüsenkrebszellkulturen und den Nukleinsäurespiegeln (SI Abb. 10) gezeigt, selbst bei Spike-in- und komplexem Plasmahintergrund. Dies ermöglicht es uns, die in der Simulation beobachteten Trends für die EV-Erfassung zu validieren, indem wir die Änderungen der Nukleinsäurekonzentrationen zwischen den Gerätebedingungen als ungefähre Anzeige der EV-Erfassung nutzen. Für jeden Parameter werden die Ergebnisse unten diskutiert:

Porendurchmesser d Wir haben TENPO-Chips mit d = 600 nm, 1 µm, 3 µm und 12 µm bewertet. Die Gesamtzahl der Membranen (n = 5), die Flussrate (ɸ = 2,5 ml/h) und die Querschnittsfläche des Geräts (a = 2,5 cm2) wurden konstant gehalten. Die Menge an EV-RNA, die unter Verwendung eines Pan-EV-Cocktails aus CD9, CD63 und CD81 im Vergleich zu einer Isotyp-Antikörperkontrolle isoliert wurde, wurde charakterisiert. Die über den pan-EV-Cocktail isolierte EV-abgeleitete RNA blieb für Porendurchmesser d = 3 µm und darunter konstant und nahm für größere Porendurchmesser ab (Abb. 3A, SI Abb. 11), was mit dem durch Simulation vorhergesagten Trend übereinstimmt (Abb. 2B). Ebenso war die mit der Isotypkontrolle isolierte EV-RNA für die niedrigeren Porendurchmesser bei d = 600 nm am höchsten, bevor sie bei d = 3 µm und d = 12 µm auf ein Minimum abfiel (Abb. 3A, SI Abb. 11), was mit übereinstimmt der durch Simulation vorhergesagte Trend (Abb. 2B). Um die Unterschiede in der gesamten porösen Fläche zwischen den Membranen mit d = 600 nm im Vergleich zu Membranen mit größerem Porendurchmesser zu berücksichtigen, haben wir auch eine Reihe von Experimenten durchgeführt, bei denen wir die Flussraten für die poröse Fläche skaliert haben, um die Strömungsgeschwindigkeit pro Pore beizubehalten Konstante. In diesem Experiment wurde derselbe Trend beobachtet, der ohne Konstanthaltung der Geschwindigkeit festgestellt wurde (SI Abb. 12).

Experimentelle Charakterisierung der TENPO-Isolierung in einem In-vitro-Modellsystem für Bauchspeicheldrüsenkrebs. Geräteparameter, die im Verlauf des Parameterscans konstant gehalten wurden, sind über jedem Diagrammsatz gekennzeichnet. Jeder Punkt stellt ein Gerätereplikat dar und Fehlerbalken stammen von n = 2 PCR-Replikaten; Jede Bedingung wurde mit zwei Replikaten des Antikörpergeräts und zwei Replikaten des Isotypgeräts durchgeführt. Die Fold-Change-Anreicherung ζ wurde für jede Bedingung als 2^(∆Cq) für den ∆Cq zwischen Antikörper- und Isotyp-Geräten berechnet. (A) Isolierte EV-RNA als Funktion der Porendurchmesser d für Antikörper-markierte gegenüber Isotyp-markierten EVs. (B) Isolierte EV-RNA als Funktion der Membrannummer n für Antikörper-markierte gegenüber Isotyp-markierten EVs. (C) Isolierte EV-RNA als Funktion der Flussrate ɸ für Antikörper-markierte gegenüber Isotyp-markierten EVs. (D) Isolierte EV-RNA als Funktion der Querschnittsfläche a für Antikörper-markierte gegenüber Isotyp-markierten EVs.

Membrannummer n: Wir haben die Auswirkung des Stapelns mehrerer Membranen in Reihe auf das Einfangen von Antikörper-markierten gegenüber Isotyp-markierten EVs untersucht. In diesen Experimenten wurden der Porendurchmesser d = 3 µm, die Durchflussrate ɸ = 2,5 ml/h und die Gerätequerschnittsfläche a = 2,5 cm2 konstant gehalten. Experimentell beobachteten wir einen Anstieg der gewonnenen Ziel-EV-RNA mit zunehmender Anzahl der Membranen (Abb. 3B, SI Abb. 11), und dieser Trend ähnelte dem vorhergesagten Trend in der Simulation, bei dem die Menge der erfassten Ziel-EVs mit zunehmender Anzahl zunahm Die Anzahl der Membranen stieg auf n = 3, blieb aber darüber hinaus auf einem Plateau (SI Abb. 3). Im Gegensatz zum vorhergesagten Anstieg des Hintergrunds aus der Simulation blieb die experimentelle Messung isotypmarkierter EV-Nukleinsäuren über n = 1 bis n = 5 Membranen konstant (Abb. 3B, SI Abb. 11). Wir vermuten, dass dieser Unterschied darauf zurückzuführen sein könnte, dass die Cq-Werte für den Isotyp-Hintergrund näher an der Nachweisgrenze unserer PCR-Assays liegen (Cq-Werte von > 33).

Flussrate ɸ Wir haben vier verschiedene Flussraten berücksichtigt: ɸ = 0,5 ml/h, 2,5 ml/h, 10 ml/h und 25 ml/h, wobei der Porendurchmesser d = 3 µm, die Membranzahl n = 3 und beibehalten wurden Gerätequerschnittsfläche a = 2,5 cm2 konstant. Wie durch Simulation vorhergesagt, beobachteten wir eine Abnahme der wiederhergestellten Ziel-EV-RNA, wenn die Flussrate ɸ zwischen ɸ = 2,5 ml/h und ɸ = 10 ml/h anstieg. Im Gegensatz zur Simulation beobachteten wir dann jedoch, dass die wiederhergestellte Ziel-EV-RNA bei Flussraten ɸ > 10 ml/h ein Plateau erreichte, anstatt abzunehmen (Abb. 3C, SI Abb. 11). Dieser Unterschied kann auf Unterschiede bei der magnetischen Kennzeichnung zurückzuführen sein, bei der Elektrofahrzeuge mit mehr als 15 MNPs immer noch bei hohen Durchflussraten erfasst werden. Wir beobachteten bei keiner der Flussraten eine Veränderung der isotypmarkierten EV-RNA, im Gegensatz zum vorhergesagten Rückgang des Hintergrunds in der Simulation. Wie beim Membrananzahl-Scan gehen wir davon aus, dass die Isotyp-Hintergrund-Cq-Werte näher an der Nachweisgrenze unserer PCR-Assays liegen. Wir beobachteten den größten Unterschied zwischen den mit Antikörpern markierten und den mit Isotypen markierten EVs bei einer Flussrate von ɸ = 2,5 ml/h (Abb. 3C, SI Abb. 11).

Querschnittsfläche: Wir haben vier verschiedene Querschnittsflächen a (Designs für alle in SI Abb. 13 gezeigten Geräte) für die TENPO-Geräte getestet und dabei den Porendurchmesser konstant bei d = 3 µm gehalten. Um die Strömungsgeschwindigkeit pro Pore konstant zu halten, haben wir die Änderungen der gesamten offenen Fläche durch Änderung der Proben- und Waschdurchflussraten kompensiert. Wir beobachteten einen kleinen (< 1 ∆Cq) Anstieg sowohl des Antikörper-markierten EV-Signals als auch des Isotyp-markierten EV-Signals, der mit zunehmendem a skalierte (Abb. 3D, SI Abb. 11). Wir beobachteten auch eine Abnahme der Fold-Change-Anreicherung zwischen Antikörper-markiertem und Isotyp-markiertem EV-Nukleinsäuresignal mit zunehmendem a (Abb. 3D, SI Abb. 11).

Es ist bekannt, dass Elektrofahrzeuge in ihrer Größe und ihrer Oberflächenmarkierungsausprägung heterogen sind, und unsere Ergebnisse spiegeln dies wider. Die aus unserem Modellsystem mithilfe der „pan-EV“-Marker (CD9, CD63, CD81) isolierte RNA-Fracht war signifikant (p < 0,05) größer als die Isotyp-Antikörperkontrolle. Signifikante Unterschiede zur Isotyp-Antikörperkontrolle wurden auch für mindestens einen Nukleinsäuremarker für CD9, CD63 und CD81 einzeln beobachtet (p < 0,05). Von den drei Einzelmarkern lieferte CD9 mehr RNA im Vergleich zu CD63 und CD81 (SI Abb. 14), was mit ELISA übereinstimmte (SI Abb. 15). Wir haben auch die Variabilität unserer TENPO-Isolierung von Lauf zu Lauf quantifiziert. Bei einem Vergleich von Pan-EV-EV-Isolierungen, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden (sechs Antikörper- und sechs Isotyp-Replikate), beobachteten wir eine Standardabweichung < 1 Cq (ähnlich unserer PCR-Replikatvariation) (SI Abb. 16). Eine einfaktorielle ANOVA ergab keine signifikanten Unterschiede für jeden Marker innerhalb der Antikörper- oder Isotypreplikate für KRT18 und H3F3A (p > 0,05), während es für GAPDH einen signifikanten Unterschied zwischen den Antikörperreplikaten gab (p = 0,014). nicht der Isotyp repliziert (p > .05).

Wir haben die TENPO EV-Isolierung mit herkömmlichen Methoden verglichen. Basierend auf den Ergebnissen des vorherigen Abschnitts haben wir uns für die Verwendung von TENPO-Chips mit n = 3 Membranen, d = 3 µm und a = 2,5 cm2 entschieden, die mit einer Durchflussrate ɸ = 2,5 ml/h betrieben werden. Wir fanden heraus, dass die RNA-Fracht (KRT18, GAPDH, H3F3A, KRAS, CD63), die mit TENPO (CD9, CD63, CD81) aus Zellkulturmedien isoliert wurde, bei der PCR (R2 = .98) gut mit der mit UC isolierten Ladung korrelierte (Abb. 4A). Wir gehen davon aus, dass zusätzlicher Nicht-EV-Hintergrund und Zelltrümmer für die niedrigeren Cq-Werte (d. h. zusätzliches Nukleinsäuresignal) verantwortlich waren, die bei den UC-isolierten EVs im Vergleich zu TENPO beobachtet wurden, bei dem Pan-EV-Marker verwendet wurden, deren Expression nicht unbedingt universell ist alle Elektrofahrzeuge über alle Zelllinien hinweg35. Die zusätzliche Beibehaltung des potenziellen Nicht-EV-Hintergrunds bei UC wird durch nachfolgende Experimente gestützt, bei denen UC gegenüber TENPO durch die Isolierung von EVs aus gesundem menschlichem Plasma herausgefordert wurde. Hier erreichte TENPO im Vergleich zu UC einen viel höheren Abbau von Albumin, einem herkömmlichen Maß für den Nicht-EV-Hintergrund und die relative EV-Reinheit36 (36× vs. 4,5×) (SI Abb. 17). Im Gegensatz dazu waren die Gesamtzahl der isolierten EVs, die Größenverteilung (SI Abb. 18) und das Gesamtprotein im EV-Isolat (SI Abb. 17) zwischen UC und TENPO konsistent. Die REM-Aufnahme von TENPO mit magnetischen Nanoporen mit d = 3 µm bestätigte, dass das Gerät mit MNPs markierte Elektrofahrzeuge am Rand der Pore erfasste, während REM-Aufnahmen von TENPOs mit magnetischen Nanoporen mit d = 600 nm eine stärkere Verstopfung aufwiesen (Abb. 4B). Wir haben auch die Größe der gesamten EVs charakterisiert, die von TENPO eluiert wurden, entweder mit dem oben beschriebenen Pan-EV-Pulldown oder einem Fünf-Marker-Tumor-Pulldown (EpCAM, CD44v6, Tspan8, CD104, c-Met), der in unserer zuvor veröffentlichten Arbeit6 beschrieben wurde. Wir quantifizierten das eluierte EV-Isolat und stellten fest, dass die Größe der mit TENPO isolierten EVs mit den mit UC isolierten EVs übereinstimmte und aus unserer früheren Arbeit an TENPO resultierte (Abb. 4C) (SI Abb. 18)5,37.

In-vitro-Benchmarking von TENPO mit Goldstandard-Technologien und in verschiedenen biologischen Systemen. (A) Korrelation der Nukleinsäureladungen zwischen TENPO und UC. Jeder Punkt entspricht einem Nukleinsäuremarker, der in den mit TENPO isolierten CD9/CD63/CD81+-EVs gemessen wurde, im Vergleich zu denselben Nukleinsäuremarkern, die in mit UC isolierten Elektrofahrzeugen gemessen wurden. Fehlerbalken von n = 2 Geräte-/Vorbereitungsreplikaten. (B) SEM-Aufnahmen von Elektrofahrzeugen, die auf TENPO aufgenommen wurden. Die linken und mittleren Aufnahmen zeigen ein TENPO mit d = 3 µm magnetischen Nanoporen. Die rechte Mikroaufnahme zeigt ein verstopftes TENPO mit d = 600 nm magnetischen Nanoporen. (C) Größenverteilungen von Elektrofahrzeugen, die von TENPO erfasst und zur Messung durch NTA eluiert wurden. (D) Vergleich von ∆Cq zwischen in Plasma gespikten Krebszellkulturmedien und in Plasma gespikten Kontrollzellkulturmedien für pan-EV TENPO im Vergleich zu einem kommerziellen Pan-EV-Kit. Fehlerbalken aus n = 2 Geräte-/Vorbereitungsreplikationen (zwei Fälle, zwei Kontrollen) unter Verwendung der Fehlerfortpflanzung. (E) Vergleich von ∆Cq zwischen mit Antikörpern markierten und mit Isotypkontrolle markierten EVs in drei verschiedenen Krebsmodellsystemen. Fehlerbalken von n = 2 Geräte-/Vorbereitungsreplikationen (zwei Antikörpergeräte, zwei Isotypgeräte) unter Verwendung der Fehlerfortpflanzung.

Wir verglichen auch die Fähigkeit von TENPO, EV-Nukleinsäureladungen aus komplexen Hintergrundproben menschlicher Patientenproben zu isolieren, mit einem kommerziellen Pan-Exosomen-Isolierungskit (Fujifilm). Wir haben TENPO und das kommerzielle Affinitätskit mit zwei verschiedenen Probentypen herausgefordert. Wir haben entweder 250 µL Zellkulturmedium für Bauchspeicheldrüsenkrebs oder 250 µL Kontrollzellkulturmedium (Medium, das keinen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen ausgesetzt war) in 750 µL gesundes menschliches Plasma gegeben. Wir haben für dieses Experiment einen Pan-EV-Pulldown gewählt, um am besten zu bestehenden kommerziellen Pan-EV-Plattformen zu passen. Der Unterschied in der Nukleinsäureladung der aus jeder Probe mit jeder Methode isolierten EVs zeigte eine enge Korrelation bei der PCR (R2 = 0,96) zwischen TENPO und dem kommerziellen Affinitätskit (Abb. 4D).

Schließlich haben wir die Modularität von TENPO über mehrere Krankheitskontexte hinweg demonstriert. Unter Verwendung von Zellkulturmodellen für Bauchspeicheldrüsenkrebs, Leberkrebs und Lungenkrebs verwendeten wir aus der Literatur abgeleitete tumorspezifische Antikörper-Panels, um EVs aus mit FBS versetzten Zellkulturmedien zu isolieren. Wir verglichen zunächst die Isolierung von EVs für jedes Antikörper-Panel mit Isotyp-Kontrollen und beobachteten eine Antikörper-vermittelte Anreicherung von EV-abgeleiteten Nukleinsäuren für alle drei Krebsantikörper-Pulldowns (Abb. 4E). Anschließend haben wir TENPO mit Spike-In-Proben herausgefordert, die aus „Krebs“-Spike-Ins mit konditioniertem Krebszellkulturmedium, versetzt in gesundes menschliches Plasma, im Vergleich zu „gesunden“ Kontrollen mit gesundem menschlichem Plasma, versetzt mit einem äquivalenten Volumen nicht konditionierter Zellkulturmedien, bestanden . Bei allen drei Krebsarten zeigte TENPO starke ∆Cqs zwischen den Krebs- und gesunden Spike-in-Plasmaproben (SI Abb. 19). Zusammengenommen verdeutlichen diese Ergebnisse die Modularität von TENPO, das kommerziell erhältliche Antikörper für eine Vielzahl von Zielen für die Isolierung von EV-Subpopulationen aus komplexen Proben verwenden kann.

In dieser Arbeit präsentieren wir die Modellierung und experimentelle Charakterisierung des Parameterraums, der die Leistung von TENPO bei der parallelisierten immunomagnetischen Nanoporen-EV-Sortierung steuert. Wir zeigen, dass durch die Steuerung des Porendurchmessers d, der Durchflussrate ɸ und der Anzahl der Membranen in Serie n die Wiederherstellung gezielter EV-Subpopulationen präzise mit der Erfassung unspezifischer Hintergrundmaterialien aus klinischen Proben ausgeglichen werden kann. Wir haben die genaue Sortierung von TENPO und die zugrunde liegenden Skalierungsgesetze experimentell anhand eines Modellsystems für Bauchspeicheldrüsenkrebs validiert. Wir haben die Modularität dieses Ansatzes über mehrere Krebsmodellsysteme hinweg im Vergleich zu mehreren Kontrollen und sowohl in kommerziellen als auch in konventionellen Methoden demonstriert.

Während unsere Finite-Elemente-Simulationen von TENPO nützliche Trends in der Leistung von TENPO erfassten, gibt es mehrere Einschränkungen. In dem für diese Arbeit verwendeten Modell betrachteten wir Elektrofahrzeuge, die an 15 MNPs gebunden waren, im Vergleich zu Elektrofahrzeugen, die an 1 MNP gebunden waren. In der Praxis wird die Anzahl der MNPs pro Elektrofahrzeug als eindeutige Verteilung für jede Anwendung dargestellt. Darüber hinaus ist ein Nukleinsäuresignal von einem Ziel-EV nicht unbedingt auf eine einzelne EV-Subpopulation beschränkt und kann aufgrund der EV-Heterogenität und der Rolle von Nukleinsäuren in unterschiedlichen biologischen Signalwegen in Hintergrund-EVs enthalten sein. Darüber hinaus können Elektrofahrzeuge desselben Zielzelltyps eine heterogene Expression spezifischer Nukleinsäuren aufweisen, was die Quantifizierung der absoluten Anzahl von Elektrofahrzeugen, die spezifische Oberflächenmarker exprimieren, mithilfe von Nukleinsäuremarkern schwierig macht. Aus diesem Grund haben wir uns beim Vergleich unserer experimentellen Daten mit unseren Simulationsdaten hauptsächlich auf relative Änderungen zwischen verschiedenen Betriebsbedingungen des Geräts konzentriert. TENPO könnte auf größere Elektrofahrzeuge ausgerichtet sein, die über ihre größere Oberfläche mehr magnetische Nanopartikel binden können. Dies könnte durch die Verwendung kleinerer Nanopartikel zur Markierung im Vergleich zu den in dieser Studie verwendeten kommerziell erhältlichen 50-nm-Nanopartikeln optimiert werden. Schließlich analysieren die hier vorgestellten Simulationsergebnisse die Parameter einzeln und halten alle anderen Parameter konstant. Dabei wird davon ausgegangen, dass jeder Parameter einen unabhängigen Einfluss auf den Gerätebetrieb hat und keine Wechselwirkung zwischen den Parametern besteht. Weitere Leistungsverbesserungen könnten erzielt werden, wenn solche Interaktionen charakterisiert würden, möglicherweise mithilfe automatisierter Algorithmen zur Versuchsplanung38.

Damit EV-abgeleitete Biomarker klinische Anwendung finden, sind Techniken mit Herstellbarkeit und Durchsatz erforderlich, die für eine große Anzahl (n > 1000) klinischer Proben geeignet sind. Aufgrund seiner geringen Bau-/Betriebskosten (Kosten für einen Pan-EV-Prototyp-TENPO-Assay = ~ 35 $; 12 $ Material/Herstellung5, 5 $ Antikörper, 18 $ Perlen) und Kompatibilität mit der Rolle-zu-Rolle-Herstellung könnte TENPO auf skaliert werden schnelle Chipherstellung bei gleichzeitigem Durchsatz für große klinische Kohorten. Die Herstellungskosten von TENPO hängen nicht vom Porendurchmesser ab, im Gegensatz zu den meisten mikrofluidischen Ansätzen, die auf lithografischer Herstellung basieren. Frühere Arbeiten in unserer Gruppe mit TENPO unter Verwendung von 600-nm-Poren zur Isolierung von EV-Subpopulationen konnten klinisch relevante diagnostische Informationen in n = 204 Proben von Bauchspeicheldrüsenkrebs6 sowie in n = 96 Proben von traumatischen Hirnverletzungen10 liefern. In diesen Fällen war TENPO mithilfe von 600-nm-Poren in der Lage, biologische Nukleinsäuresignale vom Hintergrund zu unterscheiden, was durch die in diesem Manuskript vorgeschlagene 10-fache Verbesserung der Spezifität gegenüber dem Isotyp-Hintergrund noch weiter verbessert werden kann.

Die Entwicklung von TENPO zur Isolierung von EV-Subpopulationen aus klinischen Proben bietet neue Möglichkeiten für die Entwicklung von Biomarkern und das Verständnis der EV-Biologie. Während sich die EV-basierte Diagnostik in Richtung klinischer Anwendung bewegt, hat die Literatur gezeigt, wie die EV-Heterogenität die Krebsbiologie vorantreibt39, die Diagnostik beeinflusst40,41 und Ladungen in verschiedenen EV-Typen moduliert42. Durch die immunmagnetische Isolierung über spezifische Oberflächenmarker kann TENPO die EV-Heterogenität nutzen, indem es verschiedene EV-Subpopulationen aus einer einzelnen Patientenprobe sortiert. Analyten wie Blutplättchen43, weiße Blutkörperchen44 und zirkulierende Tumorzellen45 haben sich bei der Diagnose von Krebs als vielversprechend erwiesen, und ihre EV-Subpopulationen könnten einzigartige Krebsbiomarker bieten. Um die Vielfalt der Zellen und ihrer Elektrofahrzeuge nutzen zu können, ist es wichtig, präzise Sortiertechnologien für Elektrofahrzeuge mit hohem Durchsatz zu entwickeln. Durch die Kombination der Spezifität der immunmagnetischen Markierung mit der verbesserten Ausbeute und dem hohen Durchsatz der Parallelisierung bietet TENPO das Potenzial für die schnelle Isolierung von aus EV-Subpopulationen abgeleiteten Biomarkern sowohl für die klinische Anwendung als auch für biologische Untersuchungen.

Finite-Elemente-Simulationen wurden über COMSOL 5.3 unter Verwendung des Moduls „Magnetic Fields, No Currents“ für die Magnetfeldsimulation und des Moduls „Laminar Flow“ für die Strömungssimulation durchgeführt. Die Ergebnisse der Magnetfeld- und Laminarströmungssimulation wurden dann mithilfe des Moduls „Particle Tracking for Fluid Flow“ kombiniert, um Partikelverfolgungssimulationen durchzuführen. Ähnlich wie in unserer vorherigen Arbeit37 wurden die relativen Permeabilitäten der Materialschichten auf TENPO in COMSOL so eingestellt, dass sie sich den Sättigungsmagnetisierungswerten der 200-nm-NiFe-Schicht im Gerät (~ 7900 Gauss)46 bei einem Eingangsfeld von 341.000 A/m37 annähern . Zur Modellierung von EV-MNP-Komplexen wurde eine Kugel mit 200 nm Durchmesser gewählt, da ihr Volumen einem EV mit 150 nm Durchmesser + 15 MNPs mit 50 nm Durchmesser entsprach. Die relative Durchlässigkeit der Flüssigkeit und einer 5 µm dicken Polycarbonat-Trägerschicht wurde auf eins eingestellt. Die Zahlen der magnetophorenen Kräfte wurden unter Verwendung der extrahierten Werte aus COMSOL-Simulationen in Kombination mit einer Formulierung aus47 bestimmt. Für diese MNPs wurde eine Sättigungsmagnetisierung von 95 Am2/kg verwendet, was im Bereich von 80–100 Am2/kg liegt, der für Magnetit und Maghemit angegeben wurde48. Wir haben MNPs mit einem Eisenoxidkern von 6 nm Durchmesser in einer Hülle aus nichtmagnetischem Material mit einem hydrodynamischen Gesamtdurchmesser von 50 nm simuliert. Die unterschiedliche Markierung von Elektrofahrzeugen auf dem Chip wurde simuliert, indem die relative Permeabilität des in COMSOL simulierten EV-MNP-Komplexes für die stark markierten (15 MNPs gebunden, µ = 1,00089) im Vergleich zu den schwach markierten (1 MNP gebunden, µ = 1,00009) angepasst wurde. Bedingungen in einer angepassten Formulierung37. Die maximale Anzahl von 15 MNPs wurde ebenfalls über eine Ableitung sowie SEM-Daten ausgewählt, die bestätigen, dass EVs 15 MNPs von37 binden können. Für den Scan der Porendurchmesser bei 2,5 ml/h haben wir die Porendichte für jeden Porendurchmesser so angepasst, dass die durchschnittliche vertikale Eingangsgeschwindigkeit der Flüssigkeit durch die Pore konstant blieb. Für den Scan der Verstopfungsgrößen wurden Verstopfungen als Kugeln modelliert, die am Rand einer Pore platziert wurden, wobei der Kugeldurchmesser in das Lumen der Pore hineinragte und eine konstante vertikale Eingangsströmungsgeschwindigkeit herrschte.

Zellkulturmedien wurden gemäß einem Protokoll vorbereitet, das in unserer vorherigen Arbeit detailliert beschrieben wurde und hier vollständig über37 wiedergegeben wird. Es wurden die Zelllinien Panc1 (Bauchspeicheldrüsenkrebs), SNU449 (Leberkrebs) und die Lungenkrebszelllinien H322, H358, H1975, H460, H1299 und H1264 verwendet; Alle aufgeführten Zelllinien wurden von ATCC erworben. Die Medien wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Corning), 10 % fötalem Rinderserum (Sigma-Aldrich) und 50 mg/ml Gentamicin (Gibco) in 75-cm2-Kulturflaschen kultiviert. Die Kultur wurde in einem Inkubator bei 37 °C und einer Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten. Das Medium wurde zwei- bis dreimal pro Woche erneuert und die Zellen wurden im Verhältnis 1:3 oder 1:4 subkultiviert, sobald eine Konfluenz von 80–90 % erreicht war. Zur Herstellung der konditionierten Medien wurden die Zellen in 150 mm × 20 mm große Gewebekulturschalen überführt und in einer Konzentration von 1,3 × 107 Zellen pro Schale ausgesät. Die Zellen wurden 5 Tage lang in vollständigem DMEM-Wachstumsmedium kultiviert, das mit exosomenabgereichertem FBS hergestellt wurde. Nach der 5-tägigen Inkubationszeit wurden die konditionierten Medien gesammelt und einem Zentrifugationsprozess mit zwei Zentrifugen unterzogen, um große Zelltrümmer zu entfernen: Die Medien wurden 10 Minuten lang bei 1600 × g zentrifugiert (Ausschwingbecher, Bremse aus); Der Überstand wurde isoliert und 10 min bei 3000 xg zentrifugiert (Ausschwingbecher, Bremse ausgeschaltet). Die konditionierten Medien wurden dann in 1 ml-Mengen aliquotiert und zur späteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

Sowohl Zellkulturmedien als auch Plasmaproben wurden zunächst 10 Minuten lang bei 1600 × g dreifach zentrifugiert. gefolgt von zwei 3000×g-Drehungen für 10 Minuten. um Zelltrümmer zu entfernen. Die Proben wurden dann durch eine 120.000×g-Rotation für 2 Stunden bei 4 °C pro49 in einer Beckman-Coulter Optima XL-100 K Ultrazentrifuge unter Verwendung eines Beckman-Coulter SW28 Rotors am Extrazellulären Vesikelkern an der University of Pennsylvania verarbeitet.

Das Fujifilm MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS Ver.2 wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.

Für alle Pulldowns wurden EV-haltige Proben zunächst mit den unten aufgeführten Antikörpern 20 Minuten lang auf einem Nutationsmischer inkubiert. Anschließend wurden 50 µl ultrareine magnetische Anti-Biotin-Nanopartikel (Miltenyi) hinzugefügt, um an die biotinylierten Antikörper zu binden, die wiederum an Ziel-EVs gebunden wurden. Das Mischen erfolgte weitere 20 Minuten lang auf einem Nutationsmischer, bevor die EV-MNP-Komplexe auf den Chip verteilt wurden.

Die Geräte wurden 1 Stunde lang mit 700 µL Pluronic F-127 (1 % in entionisiertem Wasser) bei einer Flussrate von ɸ = 0,5 ml/h blockiert, bevor eine 1-ml-PBS-Wäsche bei ɸ = 15 ml/h vor der Probenzugabe durchgeführt wurde die im Manuskript angegebenen Durchflussmengen. Nach dem Probenfluss wurde das Waschen mit drei 700-µL-PBS-Waschvorgängen mit einer Waschrate von ɸ = 15 ml/h durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

CD9, CD63 und CD81 (Biolegend) wurden mit einer Antikörperkonzentration von 1,25 µg Ab/ml Probe verwendet. Alle drei Antikörper hatten die gleiche IgGK1-Kontrolle (Biolegend).

Die folgenden Antikörper wurden verwendet und gemäß unserer zuvor veröffentlichten Arbeit 1 µL jedes Antikörpers zu unserer Probe hinzugefügt6: EpCAM (Biolegend), CD104 (Thermo Fisher), c-Met (Thermo Fisher), CD44v6 (Thermo Fisher), Tspan8 (Miltenyi) . Die verwendeten Isotypkontrollen waren Biolegend IgGk2b (entsprechend EpCAM, CD104) und IgGK1 (c-Met, CD44v6) sowie die Miltenyi REA-Isotypkontrolle (entsprechend Tspan8). Die Proben wurden mit einer Flussrate von ɸ = 2,5 ml/h laufen gelassen.

Die folgenden Antikörper wurden in einer Konzentration von 1 µg Ab/ml Probe verwendet: EpCAM (Biolegend), CD151 (Miltenyi) und EGFR (Thermo Fisher). Die verwendeten Isotypkontrollen waren Biolegend IgGk2b (entsprechend EpCAM), Miltenyi REA Isotypkontrolle (entsprechend CD151) und Biolegend IgGK1 (entsprechend EGFR). Bemerkenswert ist, dass die Isolierung der Leberkrebs-EV-Subpopulation eine Filterung mit einer 0,45-µm-Filtereinheit (GE Whatman) erforderte, um eine starke Spezifität gegenüber der Isotypkontrolle zu erreichen. Die Proben wurden mit einer Flussrate von ɸ = 2,5 ml/h laufen gelassen.

Die folgenden Antikörper wurden in einer Konzentration von 1 µg Ab/ml Probe verwendet: EpCAM (Biolegend), EGFR (Novus, biotinyliert über das Miltenyi One-Step Biotinylation Kit), CD151 (Miltenyi) und Tspan8 (Miltenyi). Die verwendeten Isotypkontrollen waren Biolegend IgGk2b (passend zu EpCAM), Miltenyi REA Isotypkontrolle (passend zu CD151 und Tspan8) und Novus Rabbit IgG (passend zu EGFR). Die Proben wurden mit einer Flussrate von ɸ = 2,5 ml/h laufen gelassen.

Es wurden Spike-in-Modelle für Krebs im Vergleich zu gesunden Patienten erstellt. Die „Krebs“-Proben wurden durch Zugabe von Medien hergestellt, die vorgegebene Mengen an EVs enthielten (0,25 ml – > ~ 3 × 109 EVs für Bauchspeicheldrüsenkrebs, 1 ml – > ~ 9 × 1010 für Lungenkrebs, 1 ml – > ~ 9 × 108 für Leberkrebs) in gesundes menschliches Plasma (0,75 ml gesundes menschliches Plasma für Bauchspeicheldrüsenkrebs, 0,25 ml gesundes menschliches Plasma für Lungen- und Leberkrebs; Plasma hat eine EV-Konzentration von 2 × 1012 EVs/ml, gemessen über NTA). Zur Herstellung „gesunder“ Proben wurden den für jeden Krebsmedientyp angegebenen Volumina an gesundem menschlichem Plasma äquivalente Volumina nicht konditionierter sauberer Kulturmedien (Medien, die keinen Krebszellen ausgesetzt waren) hinzugefügt.

Für die Experimente zur Nukleinsäurecharakterisierung wurden EVs entweder nach der Isolierung für UC/kommerzielle Kits oder on-chip für TENPO in 700 µL QIAzol (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers lysiert. Es wurde ein kommerzielles RNA-Isolierungskit (miRNEasy Mini Kit) verwendet und die isolierte RNA wurde in 20 µL RNase-freiem Wasser eluiert, bevor sie bei –80 °C gelagert oder sofort zur Analyse verwendet wurde.

Das PrimeScript RT Reagent Kit (Takara) wurde verwendet, um RNA gemäß den Anweisungen des Herstellers in cDNA umzuwandeln, und diese cDNA wurde dann mithilfe von SYBR-basiertem qPCR (Bio-Rad SYBR Green Master Mix) gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgeführt. Zur Messung der miRNA-Marker wurde das miRCury LNA RT-Kit (Qiagen) zur Umwandlung von RNA in cDNA verwendet, wobei die folgende PCR über das miRCury LNA SYBR Green PCR-Kit (Qiagen) nach Herstelleranweisungen erfolgte. Die Zyklusschwellenwerte (Ct) wurden auf einem Thermocycler CFX384 C1000 von Bio-Rad gemessen, wobei die Schwellenwerte vom Gerät automatisch auf das Zehnfache der Standardabweichung der Basisfluoreszenz eingestellt wurden. Basierend auf früheren Arbeiten in unserer Gruppe wurden mRNA-Primer verwendet5,6,37.

Für die EV-Elution wurde die Isolierung bis nach den Waschschritten mit PBS wie oben beschrieben durchgeführt. Auf TENPO eingefangene Elektrofahrzeuge wurden mit 1 ml IgG-Elutionspuffer (Thermo Fisher) inkubiert, während sie 10 Minuten lang auf dem Magneten bei einer Flussrate von ɸ = 0,5 ml/h waren. Der IgG-Elutionspuffer, der EVs enthielt, wurde dann mit ɸ = 2,5 ml/h vom Chip abgewaschen, bevor er gemäß den Anweisungen des Herstellers mit 100 µL 1 M Tris-HCl neutralisiert wurde.

Die Nanopartikel-Tracking-Analyse wurde mit einem ZetaView PMX220 Twin am Extrazellulären Vesikelkern der University of Pennsylvania durchgeführt. Alle Verdünnungen wurden in entionisiertem Wasser durchgeführt und zur Anpassung der im Manuskript angegebenen Endkonzentrationen verwendet. Mit NTA gemessene Partikel wurden als EV-groß eingestuft, wenn sie im Bereich zwischen 45 und 255 nm lagen.

Track-Etch-Membranen wurden gemäß einem in unserer vorherigen Arbeit5 beschriebenen Protokoll mit Nickel-Eisen beschichtet und entweder am Singh Center for Nanotechology beschichtet (Abbildungstafeln 3A, 3B, SI Abb. 8, SI Abb. 9, SI Abb. 12). ) an der University of Pennsylvania oder über einen kommerziellen Anbieter (Chip Diagnostics) für alle anderen beschriebenen Experimente. Nach der Auswahl verschiedener Track-Etch-Membranmaterialien wurden die umschließenden TENPO-Geräte wie zuvor berichtet über lasergeschnittenes (VLS 2.3) Mylar und doppelseitiges Klebeband in5,37 unter Verwendung der in SI Abb. 13 beschriebenen Muster zusammengebaut .

Wir verwendeten einen Whole-EV-ELISA, über den wir zuvor in37 berichtet hatten, um Oberflächenproteine auf den EVs zu charakterisieren, die mit einem Präzipitationskit aus Zellkulturmedien für Bauchspeicheldrüsenkrebs isoliert wurden. Das Protokoll für diesen ELISA ist hier wiedergegeben; Zwischen jedem Schritt führten wir drei Wäschen (fünf Wäschen nach der Zugabe von HRP-Streptavidin) in einem Waschpuffer bestehend aus PBS mit 0,05 % Tween 20 durch. EVs, die über ein kommerzielles Fällungskit (Thermo Fisher) vorisoliert wurden, wurden zunächst immobilisiert unter Verwendung eines alkalischen Beschichtungspuffers (0,455 g Na2CO3, 0,90 g NaHCO3, 150 ml entionisiertes Wasser) auf einer 96-Well-Platte mit hoher Bindung (Greiner) für 2 Stunden, gefolgt von einem Blockierungsschritt über Nacht bei 4 °C im Thermo Fisher Superblock (PBS). Blockierungspuffer. Die EVs wurden dann 1 Stunde lang mit biotinylierten Nachweisantikörpern bei einer Konzentration von 2 µg/ml in jeder 200 µL 96-Platten-Vertiefung inkubiert, bevor 10 µL verdünntes 1:16.000 HRP-Streptavidin (Thermo Fisher) zugegeben und das Fluoreszenzsignal abgelesen wurde auf einem Plattenlesegerät (Tecan Infinite M200).

Rasterelektronenmikroskop-Experimente wurden am Cell and Developmental Biology Microscopy Core (Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania) nach einem zuvor von unserer Gruppe37 veröffentlichten Protokoll durchgeführt, das hier wiedergegeben wird. Nach Zugabe der Probe und Abschluss der Probenfluss- und Waschschritte wurden EV-MNP-Komplexe auf dem Chip immobilisiert. Die Proben wurden dreimal mit 50 mM Na-Cacodylat-Puffer gewaschen, 2 Stunden lang mit 2 % Glutaraldehyd in 50 mM Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,3) fixiert und in einer abgestuften Reihe von Ethanolkonzentrationen bis 100 % über einen Zeitraum von 1,5 dehydriert H. Die Dehydratisierung in 100 % Ethanol wurde dreimal durchgeführt. Nach dem Schritt mit 100 % Ethanol wurden die dehydrierten Proben 20 Minuten lang in 50 % HMDS in Ethanol inkubiert, gefolgt von drei Wechseln mit 100 % HMDS (Sigma-Aldrich Co.) und anschließender Lufttrocknung über Nacht, wie zuvor beschrieben. Anschließend wurden die Proben auf Stubs montiert und mit Goldpalladium durch Sputtern beschichtet. Die Proben wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop Quanta 250 FEG (FEI, Hillsboro, OR, USA) bei einer Beschleunigungsspannung von 10 kV beobachtet und fotografiert50.

Der EV-Proteingehalt wurde mit einem Qubit 4 Fluorometer gemessen. Zur Quantifizierung der Albuminkontamination wurde ein kommerzielles Albumin-ELISA-Kit (Thermo Fisher) für ganze EVs verwendet, die aus 1 ml menschlichem Plasma isoliert wurden, wobei entweder TENPO oder Ultrazentrifugation verwendet wurde. Eine Standardkurve wurde über 51 angepasst (SI Abb. 20). Der Albuminabbau wurde relativ zu einem aus der Literatur abgeleiteten Wert für die Albuminkonzentration im menschlichen Plasma von 4 g/dl52 berechnet; Bei einer Verdünnung von 1:500.000 ergab das ursprüngliche Eingangsplasma (Zen-Bio) ein Fluoreszenzergebnis, das deutlich über der logistischen Kalibrierungskurvengrenze von 1200 ng/ml des ELISA lag.

Gesundes menschliches Plasma wurde von Zen-Bio gekauft, einem kommerziellen Anbieter von zellbasierten Reagenzien.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Dr. Yuri Veklich für seine Unterstützung bei der Durchführung von SEM an TENPO-isolierten Elektrofahrzeugen und Dr. Luca Musante für seine Unterstützung bei NTA und Ultrazentrifugation. Die Autoren möchten die folgenden Finanzierungsquellen anerkennen: National Institute of Mental Health Grant R21MH118170, National Cancer Institute Grant R21CA236653, Paul G. Allen Frontiers Group Grant 12347, US Department of Defense Grant W81XWH1920002, National Institutes of Health Grant RM1HG010023 und National Institut für Allergien und Infektionskrankheiten R33AI147406.

Abteilung für Bioingenieurwesen, University of Pennsylvania, 210 S. 33rd St., Philadelphia, PA, 19104, USA

Andrew A. Lin, Hanfei Shen, Griffin Spychalski und David Issadore

Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3400 Civic Center Blvd., Philadelphia, PA, 19104, USA

Andrew A. Lin, Griffin Spychalski und Erica L. Carpenter

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AL und DI konzipierten und planten die Experimente und Simulationen. AL und HS führten die Experimente durch. EC stellte die Zellkulturmedienmodelle menschlicher Krebsarten zur Verfügung, die in dieser Studie verwendet wurden. AL und DI leiteten das Schreiben des Manuskripts; HS, GS und EC lieferten wichtiges Feedback und halfen bei der Gestaltung des Manuskripts.

Korrespondenz mit David Issadore.

Zur Offenlegung unserer Interessenkonflikte: Dr. David Issadore ist Gründer von Chip Diagnostics und hält Anteile an dem Unternehmen. Die anderen aufgeführten Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lin, AA, Shen, H., Spychalski, G. et al. Modellierung und Optimierung der parallelisierten immunomagnetischen Nanoporensortierung zur oberflächenmarkerspezifischen Isolierung extrazellulärer Vesikel aus komplexen Medien. Sci Rep 13, 13292 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39746-7

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Eingegangen: 09. Mai 2023

Angenommen: 30. Juli 2023

Veröffentlicht: 16. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39746-7

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